骨髓间充质干细胞移植小鼠免疫系统CD4+T细胞亚群的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.018

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (1): 106-111.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.018

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骨髓间充质干细胞移植小鼠免疫系统CD4+T细胞亚群的变化

苏绍红^1，2，张俊峰²，李倩如¹，管莎莎¹，杜英¹

1郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室，河南省郑州市 450001
2郑州大学第五附属医院检验科，河南省郑州市 450052

修回日期:2013-10-12 出版日期:2014-01-01 发布日期:2014-01-01
通讯作者: 杜英，教授，博士，硕士研究生导师，教研室主任，郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室，河南省郑州市450001
作者简介:苏绍红，男，1982年生，广西壮族自治区南宁市人，壮族，2008年郑州大学医学院毕业，郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室在读硕士，主要从事医学免疫学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81172874)

Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells affects the proliferation and function of CD4+T cells in mice

Su Shao-hong^1,2, Zhang Jun-feng², Li Qian-ru¹, Guan Sha-sha¹, Du Ying¹

1Department of Microbiology and Immunology, Basic Medical School, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China
2Department of Clinical Laboratory, the Fifth Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Revised:2013-10-12 Online:2014-01-01 Published:2014-01-01
Contact: Du Ying, M.D., Professor, Master’s supervisor, Department of Microbiology and Immunology, Basic Medical School, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China
About author:Su Shao-hong, Studying for master’s degree, Department of Microbiology and Immunology, Basic Medical School, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China; Department of Clinical Laboratory, the Fifth Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81172874

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，间充质干细胞是重要的免疫调节细胞，在自身免疫病的治疗中有潜在的应用前景。
目的：探讨间充质干细胞移植在治疗多发性硬化症等自身免疫性疾病中的机制。
方法：用小鼠制备间充质干细胞，并通过静脉将间充质干细胞输入同基因、异基因小鼠体内，观察间充质干细胞对小鼠中枢免疫器官(胸腺)、外周免疫器官(脾脏)中调节T细胞(Treg)的百分比、Foxp3及白细胞介素10和转化生长因子β1的mRNA的表达。
结果与结论：同基因及异基因间充质干细胞移植均能促进小鼠脾脏、胸腺及淋巴结中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞表达水平显著增高，促进小鼠脾脏、胸腺及淋巴结中Foxp3、白细胞介素10和转化生长因子β1 的mRNA表达水平显著增高。提示间充质干细胞移植具有治疗自身免疫性疾病的作用，该作用可能是由CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞、白细胞介素10、转化生长因子β1及Foxp3的高表达所介导。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞, Foxp3, 白细胞介素10, 转化生长因子β1, 同基因移植, 异基因移植, 多发性硬化症, RT-PCR, 流式细胞术, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells are found to have the immunoregulatory activities and a potential application prospect in the treatment of autoimmune diseases.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of transplanting mesenchymal stems cells on the treatment of multiple sclerosis.
METHODS: The mouse mesenchymal stems cells were prepared, and injected into the allogenic and syngenic normal mice, to detect the frequency of CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T cells in the spleen, thymus, and lymph nodes by flow cytometry, and to detect the Foxp3, transforming growth factor-β1, and interleukin-10 mRNA in the spleen, thymus, and lymph nodes by reverse transcription-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Transplantation of mesenchymal stem cells on normal mice led to a significant up-regulation of CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T cells, Foxp3, transforming growth factor-β1, and interleukin-10 mRNA in the spleen, thymus, and lymph nodes both in the allogenic and syngenic transplant groups. Transplantation of mesenchymal stem cells may be an available method in the treatment of autoimmune diseases, and CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T cell, Foxp3, transforming growth factor-β1, and interleukin-10 may be involved in this process.

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Key words: stem cells, bone marrow, mesenchymal stem cells, cell transplantation, transplantation, isogeneic, autoimmunity

中图分类号:

R394.2

苏绍红，张俊峰，李倩如，管莎莎，杜英. 骨髓间充质干细胞移植小鼠免疫系统CD4+T细胞亚群的变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(1): 106-111.

Su Shao-hong, Zhang Jun-feng, Li Qian-ru, Guan Sha-sha, Du Ying . Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells affects the proliferation and function of CD4+T cells in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(1): 106-111.

图/表（结果） 2

2.1 纳入实验动物数量分析 30只C57BL/6受体小鼠均分为3组，每组10只，实验过程中无脱失，均进入结果分析。

2.2 骨髓间充质干细胞体外扩增和形态 原代分离的骨髓间充质干细胞呈圆形，折光性强(图1A)。体外培养24 h可见呈圆形、胞体较小，培养三四天后可见部分细胞贴壁，呈梭形，折光性较强。培养7-10 d贴壁细胞增多、体积增大，两端长出较长突起呈长梭形，其中仍混杂有较多的异型细胞(图1B)。培养2周可见呈梭形的骨髓间充质干细胞显著增多，散在或呈簇状分布(图1C)。3周左右可见骨髓间充质干细胞多呈簇状分布，多个细胞克隆形成，细胞重叠、融合可达80%-90%(图1D)。消化传代后继续培养，细胞生长速度逐渐增快，细胞数量成倍增加。以传三四代的细胞为移植细胞(小鼠骨髓间充质干细胞)。

2.3 间充质干细胞移植对小鼠脾脏、胸腺及淋巴结中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞比例的影响 流式细胞结果显示正常小鼠脾脏、胸腺及淋巴结中CD4⁺CD25⁺ Foxp3⁺T细胞表达水平较低，同基因间充质干细胞移植及异基因间充质干细胞移植组小鼠脾脏、胸腺及淋巴结中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞表达水平均显著高于正常对照组(P < 0.05)，同基因移植组与异基因移植组小鼠脾脏、胸腺及淋巴结中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞表达水平相比较，差异无显著性意义(P > 0.05)(表1)。

2.4 间充质干细胞移植后小鼠脾脏、胸腺及淋巴结中Foxp3、白细胞介素10和转化生长因子β1 mRNA的表达水平 荧光定量PCR结果显示：正常对照组小鼠脾脏、胸腺及淋巴结中Foxp3、白细胞介素10和转化生长因子β1的mRNA表达水平较低且稳定。前期预实验显示，骨髓间充质干细胞在移植后20 d同基因移植组和异基因移植组小鼠脾脏、胸腺及淋巴结中Foxp3、白细胞介素10和转化生长因子β1的mRNA表达水平较低且与正常对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。实验观察细胞移植40 d时，同基因移植组和异基因移植组中3种因子mRNA水平均升高，而移植后60 d时，同基因移植组和异基因移植组中3种因子mRNA水平均持续升高并显著高于正常对照组(P < 0.05)。

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引言

多发性硬化症是常见的以中枢神经系统脱髓鞘为主要特征的自身免疫性疾病^[1]。大量多发性硬化症免疫病理研究证实，患者体内自身髓磷脂蛋白抗原被CD4⁺T细胞识别，触发了免疫应答导致免疫细胞异常活化，激活的免疫细胞进入中枢神经系统与表达自身髓磷脂蛋白抗原的中枢神经系统细胞相互作用，通过一系列炎性因子的作用导致中枢神经系统脱髓鞘病变^[2-3]。中枢神经系统的脱髓鞘病变主要与自身反应性T淋巴细胞过度活化、中枢神经系统炎性细胞的浸润、促炎性细胞因子和炎性递质释放增加有关^[4]。Th1和Th17细胞通过释放前炎症细胞因子γ-干扰素、肿瘤坏死因子α、白细胞介素2、白细胞介素17等激活和加重病情，尤其γ-干扰素在疾病早期即能引起髓鞘脱失和神经元损伤；Th2和CD4⁺CD25⁺调节性T细胞(Treg)通过释放细胞因子白细胞介素10、转化生长因子β、白细胞介素4等能抑制自身免疫应答而缓解疾病进展^[5-7]。

间充质干细胞是一种成体干细胞，广泛分布于骨髓、肝脏等多种组织中，能分化成中胚层和神经外胚层来源的组织细胞，如神经细胞和软骨细胞等^[8]。间充质干细胞因具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，同时也因具有易获得性、体外扩增能力强、抗原性小等特性而备受关注，成为临床应用前景十分广阔的再生来源细胞^[9]。同时，近年来的研究报道表明，间充质干细胞是重要的免疫调节细胞，不仅能抑制T细胞、B细胞、NK细胞的增殖，还具有促进Treg的产生、抑制抗原提呈细胞的成熟和抗原提呈等功能^[10-11]，因此间充质干细胞在多发性硬化症的治疗中有潜在的应用前景，但迄今间充质干细胞用于治疗多发性硬化症的机制尚不十分清楚。

文章应用小鼠制备间充质干细胞，并通过静脉将间充质干细胞输入小鼠体内，观察间充质干细胞对小鼠中枢免疫器官(胸腺)、外周免疫器官(脾脏)中调节T细胞(Treg)的百分比、Foxp3及疾病相关前炎症细胞因子及抗炎症细胞因子的表达，探讨间充质干细胞移植在治疗多发性硬化症等自身免疫病中的机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机分组设计，对比观察。

时间及地点：于2012年5月至2013年5月在郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室实验室完成。

材料：

实验动物：雌性C57BL/6小鼠36只，雄性BALB/c小鼠6只，鼠龄均为6-8周，购自郑州大学实验动物中心，生产许可证号为SCXK(豫)2010-0002。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于动善待实验动物的指导性意见》标准^[12]。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的制备与培养：分别取6只C57BL/6小鼠和6只BALB/c小鼠的胫骨和股骨，用PBS冲洗出骨髓细胞，用红细胞裂解液裂解红细胞，将骨髓细胞加入含间充质干细胞培养增殖液的细胞培养板中，调整骨髓细胞的浓度为1×10⁹ L^-¹，置于37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养箱中培养。72 h后，弃去非黏附细胞，直至细胞融合80%-90%时，用胰蛋白酶使细胞分散开，黏附的间充质干细胞传代培养10-15 d。

实验分组及处理：将剩余C57BL/6小鼠随机均分为3组，异基因移植组(n=10)：进行异基因间充质干细胞移植，将从BALB/c小鼠获取的间充质干细胞细胞悬液(200 μL，含10⁶个间充质干细胞)通过尾静脉注射至C57BL/6小鼠体内。同基因移植组(n=10)：进行同基因间充质干细胞移植，将从C57BL/6小鼠获取的间充质干细胞细胞悬液(200 μL，含10⁶个间充质干细胞)通过尾静脉注射至C57BL/6小鼠体内；正常对照组(n=10)：不做任何处理。

流式细胞术检测各组小鼠胸腺、脾脏和淋巴结中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的比例：细胞移植40 d后，各组分别处死5只小鼠，取出的胸腺、脾脏和淋巴结，制备单个核细胞悬液，加入FITC标记的抗CD4单克隆抗体(0.125 μg/10⁶)和APC标记的抗CD25单克隆抗体(0.06 μg/10⁶)进行细胞表面染色，同时做CD4、CD25的同型对照。细胞固定、破膜后，加入PE标记的抗Foxp3抗体(0.5 μg/10⁶)。染色后用FACSCalibur流式细胞仪进行检测。

RT-PCR检测各组小鼠胸腺、脾脏和淋巴结中Foxp3、白细胞介素10及转化生长因子β1的表达水平：间充质干细胞移植60 d后处死各组剩余小鼠(n=5)，分离胸腺、脾脏和淋巴结，制备单个核细胞悬液，取10⁷个细胞，并用RT-PCR试剂盒提取RNA进行扩增，引物：Foxp3，forward 5’-agg aga aag cgg ata cca-3’，reverse 5’-tgt gag gac tac cga gcc-3’；白细胞介素10，forward 5’ -ttt caa aca aag gac cag- 3’，reverse 5’-gga tca ttt ccg ata agg- 3’；TGF-β1， forward 5’- cta atg gtg gac cgc aac aac g- 3’，reverse 5’- gca ctg ctt ccc gaa tgt ctg -3’。

主要观察指标：①骨髓间充质干细胞移植后小鼠胸腺、脾脏及淋巴结CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的水平变化。②骨髓间充质干细胞移植后小鼠胸腺、脾脏及淋巴结中Foxp3、白细胞介素10及转化生长因子β1水平的变化。

统计学分析：所有数据均用x(_)±s表示，组间比较行方差分析，应用SPSS 13.0软件对数据进行分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

间充质干细胞是一种重要的免疫调节细胞，众多体内体外实验表明，间充质干细胞在刺激后，如体内创伤或体外某些细胞因子刺激对免疫系统表现出很强的抑制作用^[13-15]，因此间充质干细胞正被积极尝试应用于减少免疫排斥，延长移植物存活时间，治疗相关免疫失调症^[16-18]，以及各方面相关疾病。于洋等^[19]观察了骨髓间充质干细胞Fas/FasL介导的免疫调节在结肠炎治疗中的作用，实验建立了动物结肠炎模型，卵巢摘除小鼠骨质疏松及假手术模型，对比注射卵巢摘除组与假手术组小鼠骨髓间充质干细胞治疗结肠炎的效果，检测2组骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞趋化及凋亡的差异，结果显示注射雌激素缺乏所致骨质疏松小鼠的骨髓间充质干细胞与注射假手术组骨髓间充质干细胞比较，表达Fas/FasL降低，从而使T淋巴细胞趋化及凋亡能力减弱，导致用卵巢摘骨髓间充质干细胞治疗结肠炎效果较差。王月等^[20]研究了骨髓间充质干细胞诱导调节性B淋巴细胞(Breg细胞)的免疫负调节作用，取多巴胺大鼠骨髓间充质干细胞和Lewis大鼠B淋巴细胞共培养，通过不同方法分析B淋巴细胞增殖、凋亡、表型的变化和对抗原特异性T淋巴细胞增殖的影响，结果显示骨髓间充质干细胞成功诱导产生高分泌白细胞介素10的Breg细胞产生，表型为CD19⁺CD1d⁺CD5⁺，骨髓间充质干细胞显著抑制B淋巴细胞的增殖，Breg细胞能抑制抗原特异性T淋巴细胞的增殖，并增加对免疫复合物的吞噬能力。实验说明骨髓间充质干细胞诱导的Breg细胞具有明显的免疫负调节作用。贾喆等^[21]探讨静脉输注间充质干细胞对角膜移植大鼠CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞的影响，采用流式细胞仪检测细胞移植后大鼠脾脏中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg占CD4⁺T细胞的比例，结果显示治疗组大鼠各项指标均明显高于对照组，间充质干细胞可能通过上调CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg参与诱导前房相关免疫偏离，有效预防并治疗角膜移植免疫排斥反应。

间充质干细胞可通过分泌细胞因子及细胞外基质维持骨髓造血微环境的稳定，同时，可通过多种途径调节活化的淋巴细胞^[22]，但其机制尚不十分明确。

多发性硬化是中枢神经系统白质脱髓鞘性疾病^[23-24]，其确切的病因和发病机制尚不清楚，其临床表现复杂多变，传统治疗均不能延缓疾病的进程，目前很多研究证实间充质干细胞是一种具有免疫调节及神经修复功能的多能干细胞^[25-26]，同时间充质干细胞在治疗多发性硬化方面显示了初步的治疗效果，但迄今间充质干细胞用于治疗多发性硬化的机制也不十分清楚^[27-29]。因此本实验通过对小鼠的骨髓间充质干细胞移植，观察间充质干细胞对小鼠胸腺、脾脏中调节T细胞的百分比、Foxp3及白细胞介素10和转化生长因子β1的mRNA的表达，来揭示间充质干细胞移植在治疗多发性硬化症中的机制。

调节性T细胞是一个特殊的T细胞亚群，它能抑制免疫系统的激活，帮助维持稳态和对自身抗原的耐受，在保护机体对抗自身免疫反应中起着非常重要的作用^[30-31]。研究表明，间充质干细胞具有促进调节T细胞产生的作用^[32]。在本文中，实验制备两种不同来源(同基因和异基因)的间充质干细胞，并将其注射至正常小鼠体内，来观察胸腺、脾脏和外周淋巴结中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞表达水平。实验结果表明，间充质干细胞移植后同基因及异基因组小鼠脾脏、胸腺及淋巴结中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞表达水平均显著增高，进一步印证了间充质干细胞具有促进调节T细胞表达的作用，因而间充质干细胞的免疫调节作用可能是通过促进调节T细胞的增殖来实现的^[33]。

间充质干细胞对T淋巴细胞具有抑制作用，而可溶性因子在间充质干细胞的抑制作用中起到关键作用^[34-35]。研究表明转化生长因子β1和白细胞介素10具有抑制Th1反应的重要作用，在间充质干细胞介导的抑制T淋巴细胞反应中也起到很重要的作用^[36-38]。Foxp3是调节T细胞的增殖和活化过程中非常重要的转录因子，在调节T细胞抑制T细胞反应过程中起到关键的作用^[39-40]。因此在本文中，实验又检测了间充质干细胞移植后小鼠胸腺、脾脏和外周淋巴结中Foxp3、白细胞介素10和转化生长因子β1的mRNA表达水平，结果显示，间充质干细胞移植后同基因及异基因组小鼠脾脏、胸腺及淋巴结中3种因子的表达水平均显著增高，揭示在间充质干细胞移植所产生的免疫抑制反应中，Foxp3、白细胞介素10和转化生长因子β1在其中起到作用，该结果与文献所述一致^[41-42]。

综上所述，实验研究表明，骨髓间充质干细胞移植能够引起机体内CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞、Foxp3、白细胞介素10和转化生长因子β1水平的增高，因此在间充质干细胞所介导的免疫抑制反应中，这些细胞及因子起着非常重要的作用，这可能就是间充质干细胞移植用以治疗多发性硬化症等自身免疫性疾病的机制^[43-48]。但是机体的免疫反应是个极其复杂的网络机制，有很多细胞、分子如Th17细胞及白细胞介素17对机体免疫系统的调节都起着非常重要的作用^[49-50]，这些细胞、分子是否在间充质干细胞治疗自身免疫性疾病过程中起到作用目前还不清楚，还有待于进一步研究。

骨髓间充质干细胞移植小鼠免疫系统CD4+T细胞亚群的变化

Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells affects the proliferation and function of CD4+T cells in mice

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